Geenivirheen korjaus

Seuraa 
Viestejä45973
Liittynyt3.9.2015

Kysymys on harvinaisesta CADASIL-sairaudesta jonka geenivirhe aiheuttaa. Virhe johtaa siihen, että proteiinin primäärirakenteeseessa on rakennevirhe, jossa aminohappo on vaihtunut arginiinista kysteiiniksi.

Tiedän että RNAi-tekniikalla voitaisiin (tulevaisuudessa?) sulkea tuo virheellinen geeni, jolloin toimimaan jäisi terve geeni. Riittäisikö tuon terveen geenin toiminta palauttamaan elimistön toiminnan oikeaksi, vai tarvisiko virheellinen geeni saada korjattua ja tuottamaan oikeanlaista proteiinia? Virheellinen geeni tuhoaa verisuonen sileitä lihassoluja, eli ainakin tuo tuhoutuminen loppuisi, vaikka se vain suljettaisiin, kun virheellistä rakennetta ei enää syntyisi. Olenko ihan hakoteillä?

Sivut

Kommentit (33)

Vierailija
tarsku
Tiedän että RNAi-tekniikalla voitaisiin (tulevaisuudessa?) sulkea tuo virheellinen geeni, jolloin toimimaan jäisi terve geeni. Riittäisikö tuon terveen geenin toiminta palauttamaan elimistön toiminnan oikeaksi, vai tarvisiko virheellinen geeni saada korjattua ja tuottamaan oikeanlaista proteiinia?

RNAi ei varsinaisesti sulje geenejä siinä mielessä, että ne lopettaisivat mRNA transkription. RNAi perustuu geenin komplementaarisen mRNA:n pilkkomiseen, jolloin viallista proteiinia translatoiva mRNA ei pääse ribosomeihin.

Koska viallista komplementaarista mRNA:ta transkriptoiva geeni ei katoa RNAi:ssä minnekään, se jatkaa viallisen mRNA:n transkriptiota. Tästä syystä viallisen geenin DNA-juoste on korjattava, jotta toimivaa proteiinia voidaan tuottaa. Se, miten korjaat kaikkien kyseistä proteiinia translatoivien solujen juosteet onkin jo toinen juttu.

Vierailija
Fragile
tarsku
Tiedän että RNAi-tekniikalla voitaisiin (tulevaisuudessa?) sulkea tuo virheellinen geeni, jolloin toimimaan jäisi terve geeni. Riittäisikö tuon terveen geenin toiminta palauttamaan elimistön toiminnan oikeaksi, vai tarvisiko virheellinen geeni saada korjattua ja tuottamaan oikeanlaista proteiinia?



RNAi ei varsinaisesti sulje geenejä siinä mielessä, että ne lopettaisivat mRNA transkription. RNAi perustuu geenin komplementaarisen mRNA:n pilkkomiseen, jolloin viallista proteiinia translatoiva mRNA ei pääse ribosomeihin.

Koska viallista komplementaarista mRNA:ta transkriptoiva geeni ei katoa RNAi:ssä minnekään, se jatkaa viallisen mRNA:n transkriptiota. Tästä syystä viallisen geenin DNA-juoste on korjattava, jotta toimivaa proteiinia voidaan tuottaa. Se, miten korjaat kaikkien kyseistä proteiinia translatoivien solujen juosteet onkin jo toinen juttu.

Mutta eikös toinen kopio siitä geenistä (mikäli se on virheetön) tuota kuitenkin sitä toimivaa proteiinia? Mutta sitten tuleekin kysymys riittääkö pelkkä tämän toisen geenin tuottaman proteiinin määrä...

Vierailija
aquamarineOnion
Mutta eikös toinen kopio siitä geenistä (mikäli se on virheetön) tuota kuitenkin sitä toimivaa proteiinia? Mutta sitten tuleekin kysymys riittääkö pelkkä tämän toisen geenin tuottaman proteiinin määrä...

RNAi ei edelleenkään tee itse geeneille mitään. On aivan sama aiheuttaako taudin yksi (tai kaksi) dominatiivinen vai kaksi resessiivistä alleelia (eli geenin "kopiota").

Jos taudin aiheuttaa dominoiva alleeli, joka on aika epätodennäköistä, se jatkaa viallisen mRNA:n transkriptaamista ja resessiivinen, ehjä alleeli istuu kiltisti nurkassa imemässä peukkuansa. Jos taudin aiheuttaa resessiivinen alleeli, sairaan yksilön molemmat alleelit ovat viallisia, jolloin on tavallaan aivan sama, kumpi sitä mRNA:ta transkriptaa. Käytännössä sairas yksilö ei siis RNAi:n tuloksena ala tuottamaan toimivaa proteiinia.

Virallisesti RNAi suorittamaa prosessia kutsutaan geenin hiljentämiseksi, joka on aika osuva kuvaus.

Vierailija
Fragile
aquamarineOnion
Mutta eikös toinen kopio siitä geenistä (mikäli se on virheetön) tuota kuitenkin sitä toimivaa proteiinia? Mutta sitten tuleekin kysymys riittääkö pelkkä tämän toisen geenin tuottaman proteiinin määrä...



RNAi ei edelleenkään tee itse geeneille mitään. On aivan sama aiheuttaako taudin yksi (tai kaksi) dominatiivinen vai kaksi resessiivistä alleelia (eli geenin "kopiota").

Jos taudin aiheuttaa dominoiva alleeli, joka on aika epätodennäköistä, se jatkaa viallisen mRNA:n transkriptaamista ja resessiivinen, ehjä alleeli istuu kiltisti nurkassa imemässä peukkuansa. Jos taudin aiheuttaa resessiivinen alleeli, sairaan yksilön molemmat alleelit ovat viallisia, jolloin on tavallaan aivan sama, kumpi sitä mRNA:ta transkriptaa. Käytännössä sairas yksilö ei siis RNAi:n tuloksena ala tuottamaan toimivaa proteiinia.

Virallisesti RNAi suorittamaa prosessia kutsutaan geenin hiljentämiseksi, joka on aika osuva kuvaus.

"Tästä syystä viallisen geenin DNA-juoste on korjattava, jotta toimivaa proteiinia voidaan tuottaa. Se, miten korjaat kaikkien kyseistä proteiinia translatoivien solujen juosteet onkin jo toinen juttu."

Onko tällaista korjausta mahdollista tehdä? Kertoisitko hieman lisää siitä?

Kyseessä on vallitsevasti periytyvä sairaus ja toinen alleelli on samanlainen kuin terveellä ihmisellä. Samaa olen pohtinut kuin aquamarineOnionkin, että kun virheellinen geeni on hiljennetty, riittääkö terveen puoliskon toiminta.

Vierailija

On käytännössä mahdotonta korjata jok'ikisen solun DNA:sta se pätkä, joka on mutatoitunut. Onhan sitä tapoja pilkkoa DNA:ta (vaikka DNAasi) ja syntetisoida sitä lisää. Mutta nämä metodit toimivat vain äärimmäisen tarkoin kontrolloiduissa olosuhteissa (mieti PCR).

Ja solu osaa korjata viallista juostetta ihan itsekin. Mutta tässähän nyt onkin ongelmana se, ettei solu älyä, että juoste on viallinen, jolloin se ei myöskään korjaa sitä. Päinvastoin, jos teoreettisesti päästäisiin siihen vaiheeseen, että emäspari onnistutaan vaihtamaan oikeaan, solu pyrkii korjaamaan juosteen takaisin entiseen, vialliseen muotoonsa.

Yritin tuossa aikaisemmassa postissa jo selitellä, ettei se terve alleeli siitä geenistä tee yhtään mitään jos käsittelet sen pahan puoliskon RNAi:llä. Solun normaalissa toiminnassa resessiivinen alleeli ei osallistu millään tapaan proteiinin translaatioon. Jos hiljennät sen pahan puoliskon RNAi:llä, solu edelleen "luulee" tekevänsä proteiinia, vaikka mRNA ei pääsekään ribosomeihin.

Normaalisti solu käynnistää säätelymekanismit, kun jonkin proteiinin pitoisuuden huomataan olevan liian alhainen tai sille ilmenee muuten vain tarvetta. Voitanee olettaa, että se tekee näin myös tässä tapauksessa. Tällöin se ei tosin ala tuottamaan terveellä alleelilla ehjää proteiinia, vaan kiihdyttää viallisen proteiinin tuottoa esimerkiksi käyttämällä vahvempaa promoottoria.

Käytännössä siis terveen puoliskon toiminta ei riitä, koska se ei koskaan toimi.

Vierailija

Christine P. Donahue and Kenneth S. Kosik (2004) Distribution pattern of Notch3 mutations suggests a gain-of-function mechanism for CADASIL. Genomics Volume 83, Issue 1, January 2004, Pages 59-65

Ylläolevan artikkelin mukaan virheellinen alleeli tuottaa virheellistä proteiinia, jonka kasautuminen aiheuttaa CADASIL:in. Eli periaatteessa tämän virheellisen alleelin hiljentäminen voisi lieventää tautia ja jopa estää sen kokonaan. Tauti alkaa ilmetä varttuneemmalla iällä, mikä viittaisi siihen, että elimistö pärjää yhdellä toimivalla alleelilla. Oireet alkavat näkyä vasta vanhempana, koska virheellistä proteiinia on keräytynyt tarpeeksi.

Minun arvioni mukaan RNAi-tekniikasta saattaisi olla tulevaisuudessa apua. En ole tekniikan superasiantuntija, mutta voisi olettaa, että hankalauuksia tuottaisi ainakin toimivan ja virheellisen alleelin pieni eroavaisuus: RNAi todennäköisesti hiljentäisi vahingossa myös toimivaa alleelia. Koska geeniä tarvitaan yksilönkehityksessä, saattaa virheellistä proteiinia kasautua kriittisiä määriä jo sikiövaiheessa. Mutta nämä siis vain omia arvailujani.

Fragile:

Solun normaalissa toiminnassa resessiivinen alleeli ei osallistu millään tapaan proteiinin translaatioon.

Tämä on yleinen virhekäsitys. Se, että alleeli on resessiivinen, ei tarkoita, että se ei osallistuisi proteiinituotantoon. Resessiivisyys tarkoittaa (tässä tautitapauksessa) sitä, että alleelin tuote peittyy dominoivan alleelin tuotteen vaikutusten alle. Resessiivisen alleelin ominaisuudet siis näkyvät, jos dominoiva alleeli hiljennetään.

---
Lisäys: ylläolevassa artikkelissa ei puhuta mitään RNAi:stä tai taudinparantamisesta, vaan pelkästään yleistä taudista.

Vierailija
dinoflagellat
RNAi todennäköisesti hiljentäisi vahingossa myös toimivaa alleelia.

Tämä on yleinen virhekäsitys. RNAi:llä pystytään erottelemaan jopa vain yhdellä bp:lla toisistaan eroavia alleeleja. Riittää kun käytetään guide strandina sekvenssiä juuri siitä kohdasta, jossa alleelit eroavat toisistaan.

Vierailija
Fragile
dinoflagellat
RNAi todennäköisesti hiljentäisi vahingossa myös toimivaa alleelia.



Tämä on yleinen virhekäsitys. RNAi:llä pystytään erottelemaan jopa vain yhdellä bp:lla toisistaan eroavia alleeleja. Riittää kun käytetään guide strandina sekvenssiä juuri siitä kohdasta, jossa alleelit eroavat toisistaan.

Olet aikaasi edellä, tai jäljessä. Aikaasi jäljessä siksi, että tuo oli käsitys viisi vuotta sitten. Sittemmin huomattiin, että RNAi ei ole ollut yhden emäsparin tarkkuinen menetelmä. Ilmiötä kutsutaan RNAi:n off-target efektiksi (eli huti-menee-efekti). Löysin tosin viime syksyltä artikkelin, joka luo kovasti toivoa sairautta aiheuttavien pistemutaatioalleelien hiljentämiseen. Aikaasi edellä siksi siis.

Se artikkeli on tässä:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/quer ... t=Citation

Vierailija

Emäsparit sitoutuvat toisiinsa hyvinkin spesifisesti vetysidoksin. Jo yksi väärä emäs pitkässä juosteessa riittää tekemään siitä termodynaamisesti epästabiilin. Termodynamiikkaa noudattaen spesifi strandi siis sitoutuu komplementaariseen strandiinsa siihen kohtaan, johon se "sopii". Koska RNAi solussa perustuu dsRNA:n pilkkomiseen guide strandeiksi, pituudeltaan noin parikymmentä bp, huteja tulee. Syntetisoimalla ja/tai kopioimalla spesifistä juostetta ongelma voidaan kiertää. Tällöinkin tosin tarvitaan dsRNA:n entsymaalinen pilkkominen RNAi:n initiontiin.

Vierailija

Tässä artikkelissa osoitetaan, että yhden emäsparin ero ei takaa absoluuttista RNAi-spesifisyyttä:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articl ... d=15781493

"Target recognition by siRNA was initially thought to be a highly sequence-specific process mediated by the antisense strand (or so-called guide strand) of siRNA duplexes (2), and a single-nucleotide mismatch to the target was reported to abolish the gene silencing effect. --" "--The optimistic view was, however, challenged when significant off-target effects were observed in carefully designed microarray experiments. These studies showed that genes with partial sequence similarities to a siRNA were also down-regulated significantly (5). --" "-- Our results demonstrate that target sites carrying Our results demonstrate that target sites carrying single-nucleotide mutations are silenced to varying degrees and that the silencing efficiency is governed by both the position and the identity of the mismatched base pair."

Boldaukset omiani. Tiedän, että RNAi-tekniikan opetetaan yleensä olevan absoluuttisen spesifinen, mutta tämä ei ole asian laita. Mutta kuten ylemmän lainauksen lopussa todetaan, spesifisyyteen vaikuttavat erilaiset tekijät ja aiemmassa postauksessani olevassa artikkelissa ollaan jo aika pitkällä yhden pistemutaation tarkkuisessa spesifisyydessä.

Vierailija

Kyllä, kyllä, mutta kuten alunperin kirjoitin, off-target -efekti voi tuottaa hankaluuksia, mikäli CADASIL:iä RNAi-tekniikalla joskus koitetaan hoitaa, sillä yhden nukleotidin RNAi-spesifisyys ei ole itsestäänselvyys (joskin spesifisyyttä voidaan parantaa mainitsemillasi ja mainitsemani artikkelin keinoin).

Lienemme päässeet yhteisymmärrykseen?

Vierailija

Emmeköhän.

Jos kuitenkin vielä teoretisoidaan, että kyseistä voidaan hoitaa siRNA:lla, joka hiljentää viallisen alleelin protskuntuotannosta 75% ja ehjän alleelin vastaavasta tuotannosta karkeasti arvioiden 5-10%, eiköhän kyseinen metodi kannata ottaa käyttöön. Hiljennysarviot pohjautuvat jo nyt markkinoilla olevien kittien tehokkuuksiin. Eihän siinä tavallaan menetä mitään, jos muutama prosentti ehjän proteiinin tuotannosta hiljennetään. Onhan se toki ehjästä protskupoolista pois, mutta tärkeintä tässä kuitenkin on, että ehjää tuotetaan enemmän mitä viallista.

Eihän se oikeasti pohjimmiltaan ole näin yksinkertaista, rajusti yksinkertaistettuna kylläkin.

Vierailija

Kiitokset teille näistä pohdinnoista. Jotkut menivät hieman yli hilseen näin lukio-opintojen pohjalta, mutta eiköhän pääasia tullut selväksi.

Olen 26-vuotias taudin "uhri" ja kärsin jokapäiväisistä taudin aiheuttamistä ongelmista ja työkyvyttömyyseläke on kuukausien sisään tosiasia. Kaikki pienikin fyysinen rasitus aiheuttaa minulle kohtauksen, jopa vessassa käyminen, eli taistelu kohtausta vastaan on jokapäiväistä. Taudinkuvan mukaan minun ei kuuluisi olla näin sairas.

Seuraava kysymykseni on, miten voin alkaa ajamaan asiaa, että pääsisin tällaisiin hoitoihin? Mitä minun kannattaa ensimmäiseksi tehdä? Olen jo yliopistollisessa sairaalassa ilmoittanut olevani halukas vaikka koekaniiniksi, mutta asia ei etene siellä mihinkään.

Vierailija

Todella ikävä kuulla, tarsku, otan vilpittömästi osaa.

Mikäli haluat tietää tutkimuksen nykytilasta, niin suosittelisin ottamaan yhteyttä esim. sähköpostitse tutkijoihin, joita löytyy Googlen kautta hakusanoilla "cadacil research" ja pistämällä tarkennukseksi "sivuja: maasta Suomi". Jotkut tutkijat, itseni mukaan lukien, ovat todella innokkaita vastaamaan kyselyihin, mutta toiset taas... ovat inhimillisesti laiskempia.

Yliopistojen tietokantahausta ei löytynyt sanoilla CADASIL + RNAi juuri mitään, joten pahoin pelkään, että tästä aiheesta ei valitettavasti ole aineistoa. Geenitekniikan hyödyntäminen monien vakavien sairauksien hoidossa on lapsenkengissään. Yksi syy tähän on ihmiskokeiden suorittamisen tarkat säännökset (jotka tosin ovat oikeutetut), ja menetelmien uutuus ja ennustamattomuus, sekä jotkin ikävät takapakit ihmiskokeissa.

Sivut

Uusimmat

Suosituimmat